Научная деятельность

Известно, что фуллерен не растворим в воде, и поэтому его перевод в водную среду обычно осуществляется с использованием токсичных органических растворителей. По такой процедуре получения водного раствора фуллерена, выход его очень невелик, в среде остаются токсичные примеси и стоимость такого раствора весьма высока. Эти обстоятельства сильно ограничивают широкое использование фуллерена в медицине.
Наши разработки позволяют получать водный раствор фуллерена без использования токсичной органики и с высоким выходом фуллерена.

Коллектив компании «С60Био» разработал уникальный способ получения водных растворов фуллеренов без применения токсичных растворителей, ультразвуковой обработки и нагревания, что делает их пригодными для использования в медицине. Водные растворы фуллерена С60 (dnC60) получают простым смешиванием раствора C60 в N-метилпирролидоне (МП) с деионизованной водой или с водным раствором стабилизирующего агента (L-аминокислоты, моносахариды, пептиды, глицерин, амфифильные полимеры), с последующим исчерпывающим диализом против дистиллированной воды. В процессе диализа все низкомолекулярные вещества удаляются через поры, а кластеры фуллерена остаются в растворе. Эффективность трансформации C60 из кристаллического состояния в раствор приближается к количественной, при этом можно получить растворы с концентрацией С60 до 1 г/л, в зависимости от стабилизатора. Гидродинамический размер частиц фуллерена обычно составляет 60-80 нм, хотя, по данным электронной микроскопии наблюдаются также и частицы с меньшим размером. Растворы стабильны в течение, по крайне мере, около года. Устойчивость к нагреванию позволяет стерилизовать дисперсии dnC60 при 100оС. Данный метод пригоден и для получения растворов эндофуллеренов, а также для приготовления композиций лекарственных средств (ЛС).

 

Публикации и патенты:
1. Andreev S., Purgina D., Bashkatova E., Garshev A., Maerle A., Andreev I., Osipova N., Shershakova N., Khaitov M. Study of fullerene aqueous dispersion prepared by novel dialysis method: simple way to fullerene aqueous solution // Fullerenes Nanotubes and Carbon Nanostructures. — 2015. — V. 23. —  № 9. — P. 792-800. PDF

2. Андреев С.М., Башкатова Е.Н., Хаитов М.Р., Пургина Д.Д. Патент 2548971, RUS, C01B31/02, B82Y5/00, B82B3/00 Способ получения водных нанодисперсий фуллерена.— № 2013118427; заявл. 22.04.2013; опубл. 2015. PDF

3. Андреев С.М., Пургина Д.Д., Башкатова Е.Н., Гаршев А.В., Маерле А.В., Хаитов М.Р. Эффективный способ получения водных нанодисперсий фуллерена С60  // Российские нанотехнологии. — 2014. —    Т. 9. — № 7-8. — С. 24-30. PDF

Изучение биологической активности фуллерена и разработка новых лекарственных средств на основе водного раствора фуллерена С60

Наши исследования показали:

Фуллерен обладает значительной противоаллергической активностью, что показано на модели атопического дерматита.
Атопический дерматит (АД) – это наследственное хроническое аллергическое заболевание кожи с частыми обострениями, которым страдают во всем мире до 25% детей и до 5% взрослых. В настоящее время отмечается тенденция к развитию тяжелых, непрерывно рецидивирующих форм АД, устойчивых к стандартной терапии.

Основными ЛС для терапии АД и аллергических заболеваний в целом являются антигистаминные ЛС и топические глюкокортикостероиды (ТГКС). В ближайшие 10 лет планируется выведение на рынок новых препаратов, ингибирующих секрецию кальциневрина и препаратов на основе мкАТ. Однако, эти препараты имеют побочные эффекты, стоимость этих препаратов будет высокой и использоваться они будут преимущественно для терапии тяжелых форм заболевания.
Прогресс в лечении АД может быть достигнут путем использования наноуглеродных технологий, и в частности, использования фуллерена С60, как новой платформы для создания противовоспалительных препаратов. Известно, что одной из движущих сил воспалительной реакции, в том числе и аллергии, является окислительный стресс, сопровождающийся генерацией активных форм кислорода, свободных радикалов и оксида азота. Фуллерен и его соединения, как мощные антиоксиданты, способны эффективно инактивировать синглетный кислород и свободные радикалы. Это свойство делает фуллерен перспективным терапевтическим средством для лечения аллергических патологий, в том числе атопического дерматита.
В предварительных опытах на мышах, с использованием модели АД нами было установлено, что водный раствор фуллерена значительно снижает кожное воспаление. А именно, на модели АД было показано, что ВРФ обеспечивает улучшение гистологической картины аллергического воспаления, а также снижение уровня специфического IgE и цитокинов, вызывающих аллергическое воспаление. Кроме того, фуллерен С60 в определенной степени восстанавливает функцию кожного барьера, увеличивая экспрессию гена, кодирующего важнейший белок кожного барьера филаггрин.
Важным результатом применения препарата на основе фуллерена С60 может стать снижение частоты проявления АД и, как следствие, уменьшение количества случаев перехода легкой формы заболевания в тяжелую. Применение фуллерена может также снизить потребление антигистаминных препаратов, которые имеют ряд нежелательных побочных эффектов.

Shershakova N., Baraboshkina E., Andreev S., Purgina D., Struchkova I., Kamyshnikov O., Nikonova A., Khaitov M. Anti-inflammatory effect of fullerene C60 in a mice model of atopic dermatitis // Journal of Nanobiotechnology. — 2016.  —  V. 14. — № 1. — P. 1483-1493. PDF

Фуллерен проявляет выраженную противовоспалительную активность
Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) лежит в основе развития ряда заболеваний, таких как туберкулез, дифтерия, герпес, корь, грибковые инфекции, а также играет определенную роль в реакциях трансплантационного иммунитета, противоопухолевого иммунитета, аутоиммунных заболеваний и контактного дерматита. В механизмах индукции ГЗТ важная роль отводится антигенпрезентирующим макрофагам, дендритным и другим клеткам. Главным цитокином в реакциях ГЗТ является ИФН-γ, продуцируемый Тh1-клетками, который вызывает активацию макрофагов и вовлечение их в иммунный ответ, также особый вклад в патогенез дают клетки с фенотипом Th17. Невозможность элиминации антигена приводит к скоплению в ткани макрофогов, в результате чего образуются характерные гранулемы. Реакции ГЗТ часто используются для изучения клеточного иммунитета при доклинических исследованиях новых фармакологических соединений. Оценку влияния препарата осуществляют как на стадии сенсибилизации, так и разрешения, что позволяет сделать вывод о действии вещества на разные стадии клеточного иммунного ответа. Интенсивность секреции лимфоцитами факторов клеточного иммунитета соответствует степени выраженности воспалительной реакции в месте введения разрешающей дозы антигена и характеризует активность клеток, ответственных за проявление реакции ГЗТ. Исследуемый препарат может влиять на показатели реакции в ту или иную сторону в зависимости от своих свойств. Для подавления воспалительной реакции ГЗТ используют иммунодепрессанты, например циклоспорин, кортикостероиды, цитостатики, а также стабилизаторы клеточных мембран, препятствующие секреции литических факторов, антиоксиданты. Циклоспорин ингибирует продукцию цитокинов, индуцирующих активацию и дифференцировку Т-клеток. Кортикостероиды индуцируют лизис некоторых подтипов Т-клеток и блокируют транскрипцию генов ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-α в макрофагах.
Недавно нами было установлено, что водный раствор фуллерена оказывает заметный ингибирующий эффект на ГЗТ-опосредованное воспаление на экспериментальной модели на мышах. В работе было продемонстрировано снижение уровней ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-17, ИФН-γ и ФНО-α у животных, получавших dnС60 по сравнению с модельной группой. Таким образом показана противовоспалительная активность водного раствора фуллерена.
Барабошкина Е. Н. Получение и экспериментальное исследование водорастворимого фуллерена и его производных, подавляющих аллергическое воспаление: дис. канд. биол. наук: 03.03.03: защищена 28.12.16. — М., 2016. — 134 с. PDF

Фуллерен способен подавлять IgE-зависимый аллергический ответ, ингибируя секрецию гистамина
Нанодисперсия чистого фуллерена C60 оказывала ингибирующее воздействие на IgE-опосредованную секрецию гистамина из базофилов периферической крови в системе in vitro. Нанодисперсия фуллерена С60 ингибировала выброс гистамина дозозависимым образом. Максимальное ингибирование (25%) наблюдалось при 0,2 мкМ, или примерно 140 нг/мл С60.

Фуллерен проявляет ранозаживляющую активность
Проблема заживления ран и ожогов остается одной из самых актуальных проблем современной медицины. Наноуглеродные соединения, в том числе фуллерен С60, может стать основой нового поколения стимулирующих регенерацию кожи препаратов, обладающих противовоспалительной и антиоксидантной активностью.
Существование различных средств для стимуляции регенерации кожи указывает на высокую актуальность этой проблемы. Но часть препаратов имеет определенные ограничения в применении. Довольно часто острые раны трансформируются в хронические, длительно незаживающие, с осложнениями в виде воспаления. При развитии воспалительной реакции наблюдается повышенная секреция провоспалительных цитокинов и нарушение процессов цитокиновой регуляции. Повреждение тканей вызывает развитие окислительного стресса. Выраженность свободнорадикальных реакций и нарушения гомеостаза негативным образом влияют на активность регенеративных процессов в коже. При ожогах и травмах кожи наблюдается активация свободнорадикальных реакций, в результате этого запускается ряд процессов приводящих к торможению процессов синтеза белков, нуклеиновых кислот, и, в конечном счете, к замедлению процессов регенерации. Активация антиоксидантной системы может быть одним из подходов для стимуляции регенерации при травмах кожи. В связи с этим, для коррекции иммунодефицитного состояния и окислительного стресса при травмах кожного покрова необходимо применение препаратов с наличием антиоксидантной активности, что, как правило, позитивным образом сказывается на их репаративном действии.
Мы провели ряд исследований в данном направлении. Визуальная оценка результатов исследования и подсчет ранозаживляющей эффективности показали, что фуллерен С60 способен стимулировать заживление кожного покрова у мышей при моделировании раневых поражений. Патоморфологический анализ гистологических срезов кожи показал, что нанесение фуллерена С60 улучшает гистологическую картину пораженного участка кожи. Анализ изменения уровня экспрессии генов, вовлеченных в процессы регенерации, ангиогенеза и воспаления кожного покрова у мышей при нанесении фуллерена С60 показал увеличение экспрессии генов HMGB1 и VEGF-A, и подавление экспрессии генов TNFα, IL1α, IL1β, IL6.
Таким образом, по результатам проведенных исследований можно заключить, что фуллерен С60 способен стимулировать регенеративные процессы в коже и обладает противовоспалительной активностью, что делает его перспективным препаратом для терапии раневых и химических поражений кожного покрова.

Фуллерен проявляет противовирусную активность
Вирус простого герпеса (ВПГ) имеет очень широкое распространение в человеческой популяции, им инфицированы более 3,7 млрд человек в возрасте до 50 лет, антитела к ВПГ обнаружены у 80-90% населения. На территории России и СНГ различными формами герпесвирусной инфекции (ГВИ) ежегодно инфицируется около 20 млн человек. Существует два вируса простого герпеса: вирус простого герпеса типа 1 (ВПГ1) и вирус простого герпеса типа 2 (ВПГ2).
После первичного заражения вирус простого герпеса 1 типа (ВПГ-1) может вызывать литическую инфекцию и гибель зараженных клеток или переходить в латентную форму. Различные факторы внешней и внутренней среды индуцируют реактивацию вируса и развитие рекуррентной инфекции. Рекуррентная ВПГ-1 – инфекция отмечается более чем у 30% людей, может протекать без клинически выраженных симптомов, но способствовать горизонтальной и вертикальной передаче вируса. ВПГ-1 вызывает заболевания кожи, в том числе герпетическую экзему, поражения многих органов и тканей. Вирионы ВПГ-1 могут транспортироваться в ЦНС и вызывать угрожающие жизни заболевания, чаще всего геморрагический энцефалит. Около 20% менингоэнцефалитов имеют герпесвирусную этиологию. Помимо тяжелых неврологических последствий ВПГ-1 –инфекция может быть причиной радикулита, миелита или менингита. В настоящее время доказано, что ВПГ-1 может передаваться половым путем и быть причиной генитального герпеса наряду с вирусом простого герпеса 2 типа (ВПГ-2). Показано, что герпесвирусная инфекция может быть причиной бесплодия в браке, недоношенности, развития различных фетопатий и мертворожденности.
На основе водного раствора фуллерена С60 нами была разработана композиция крема для топического применения. Опыты на лабораторных животных, проведенные на базе Института вирусологии НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, показали, что фуллерен обладает ярко выраженными противовирусными свойствами. Представленные данные подтверждают перспективность использования фуллерена, как обладающего противогерпетическим действием, в качестве местного применения при воспалительных процессах, вызванных герпесвирусами человека.
Таким образом, фуллерен С60 может рассматриваться в качестве кандидатного противовирусного препарата, поскольку обладает:
• высокой активностью против ВПГ1;
• противовоспалительной активностью;
• ранозаживляющей активностью;
• наличием двух типов мишеней (вирусных и клеточных), что позволяет предполагать активность в отношении резистентных штаммов ВПГ;
• высоким индексом селективности (от 100 до 1000);
• практически полным отсутствием токсичности в условиях in vivo – в том числе, при продолжительном введении.

Klimova R, Andreev S, Momotyuk E, Demidova N, Fedorova N, Chernoryzh Y, Yurlov K, Turetskiy E, Baraboshkina E, Shershakova N, Simonov R, Kushch A, Khaitov M, Gintsburg A. (2019) Aqueous fullerene C60 solution suppresses herpes simplex virus and cytomegalovirus infections. Fullerenes, Nanotubes and Carbon Nanostructures, https://doi.org/10.1080/1536383X.2019.1706495 PDF